크로마토크래피

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1. Q.

   직렬로 연결된 PID/FID에서 디젤 표준(diesel standard)을 분석할 때, C16이상의 탄화수소들이 현저하게 감소하고 피크의 흔적 또한 부정확해지는 흥미로운 현상을 관찰하였습니다. 이러한 이유는 무엇입니까?

   A.

   이것은 PID에서 축합의 증후입니다. 분석물의 상대적인 휘발성이 감소할수록, 그 영향이 명백해집니다. 일반적으로, 감지기의 온도를 250℃ 근처의 온도 상한선까지 증가시킴으로써 이와 같은 현상을 최소화 시킬 수 있습니다. PID 램프의 생명은 고온에서 크게 감소되기 때문에 화합물들은 휘발성 범위에 한정되야 합니다.

2. Q.

   EPA Method 8270(준휘발성 유기물질의 GC/MS부터 모세관 컬럼 테크닉까지)은 다섯-포인트 보정 곡선(전형적으로20, 40,80, 120,160 ppm)을 요구합니다. EPA에서는 30 미터, 1.0 μm필름의 0.25 mm I.D.를 추천하기 때문에 제 크로마토그램이 120 and 160 ppm standard에 대한 과부하 현상을 보입니다. 이런 경우에 어떻게 해야 합니까?

   A.

   1.0μm필름의 0.25 mm I.D. 모세관 컬럼은 하나의 매트릭스 내 각각의 분석물질을 대략 125에서 75 ng1정도 다룰 수 있습니다. 즉, 만일 각각 100 ppm의 두 성분으로 혼합된 1.0 μL의 시료가 있다면, 전체적으로 200 ng에 대해 컬럼은 과부하 되지 않을 것입니다. 컬럼이 과부하 되면, 분석가들은 큰 용량의 컬럼을 선택할 수도 있습니다.(e.g., a 0.32 mm I.D. column with comparable b).

    불행히도, 모든 benchtop GC/MS 시스템들이 0.32 mm I.D.컬럼의 흐름속도보다 큰 흐름을 다룰 수 있는 것은 아닙니다. 또 다른 해결 방법은 적은 양의 시료가 컬럼에 도입될 수 있도록 컬럼의 꼭대기를 주입기 내부에 위치하게 하는 것입니다. 주입기 판별은 모든 농도에 대해 일정하기 때문에 보정 곡선은 직선으로 남아있습니다. 이것은 대부분의 분석자들에 대해 가장 간단한 해결방법이 될 수도 있습니다. 차선책으로 split 도입은 컬럼에 대한 분석물의 양을 감소시킬 수 있습니다(e.g., 25:1) 가장 늦게 용리되는 화합물과 미량의 화합물들 대부분은 감지하기 어려울 것입니다.

3. Q.

   가드(Guard) 컬럼은 얼마나 길어야 하나요?

   A.

   가드 컬럼들은 전형적으로 0.5에서 10미터의 길이입니다. 비록 모든 시료에 좋은 절대적인 길이는 없지만, 다음의 guideline이 도움이 될 것입니다. 만약 시료 매트릭스가 상대적으로 “clean”(비휘발성 화합물이 작은 농도)하고 분석 물질들은 반응성이 있을 경우 가드 컬럼은 0.5에서 1미터의 길이를 가져야 합니다. 만약에 시료 매트릭스가 더럽다면, 가드 컬럼은 반드시 길어야만 합니다. (비휘발성 화합물을 모으기 위해서) 5내지 10미터가 시스템 유지를 간단히 하는데 도움을 줍니다. 더욱 긴 가드 컬럼은 전체 가드 컬럼을 교체하는 것 대신에 처음 1미터를 간단하게 자르고 주입기를 다시 설치할 수 있게 해줍니다.

4. Q.

   집에서 만든 dual-컬럼 조립에서 흐름을 맞추는 것과 몇몇의 분석 물질들을 분리하는데 문제가 있습니다. 도와주세요!

   A.

   비록 컬럼 제조사들이 특정 치수들을 명시하지만 그 치수들이 정확하지는 않습니다. 이것은 단일 주입기에서 컬럼을 커플링할 때 이중-컬럼 분석에서 문제점을 유발할 수 있습니다. J&W에서는 컬럼 연결 서비스를 제공합니다. 그러나, 스스로 해보고 싶으면, 다음 내용을 따라 해 보십시오.

    

   Y splitter의 컬럼과 가드 컬럼을 연결시킵니다. 총 연결 부위를 확인합니다. 화합물을 감지할 수 있고 남지 않게 할 수 있는 온도까지 컬럼을 가열합니다(150°C 정도). 화합물의 용리 시간을 기록합니다. 만약 0.1분 보다 나중에 용리된다면, 나중시간의 컬럼에서 10-15cm를 자릅니다. 유지되지 않는(Nonretained) 화합물들이 두 컬럼에서 0.1분 내에 용리될 때까지 컬럼의 흐름을 거의 같게 만들면서 이 과정을 반복합니다. 분해기준이 맞아떨어질 때까지 전형적인 조건에서 표준물질을 분석합니다. 하나 또는 두개의 컬럼으로 분해하기 힘든 한쌍의 화합물들을 선택하니다. 5에서 10분 사이에 화합물을 용리할 수 있도록 충분하게 컬럼 오븐의 온도를 올리고, 화합물을 주입한 다음 두 컬럼에서 용리되는 시간들을 기록합니다. 같은 분석법에 대해서 새로운 이중 컬럼을 설치할 때, 두 번째 문단의 과정을 반복하고, 선택된 화합물들을 주입하고 두 컬럼에 대한 머무름 시간이 전에 기록된 시간의 범위 내에 들 때까지 head 압력을 적용시킵니다.

5. Q.

   새로운 컬럼의 조건을 잡는 것에 대해서 의견이 분분하다고 들었습니다. 몇몇 동료들은 조건 잡는 것은 필요치 않다고 하고 또 몇몇 동료들은 밤새도록 말려야 한다고 하며, 나머지 사람들은 컬럼을 천천히 온도를 내려야 한다고 합니다. 이럴 경우 어떻게 해야 합니까?

   A.

   컬럼의 온도 상한선을 넘지 않으면서 오븐 프로그램의 마지막 온도보다 대략 20도 정도 높은 온도를 새로운 캐필러리 컬럼 조건을 잡습니다. 만약 분석 시 컬럼의 등온한계보다 높은 온도가 요구된다면, 더 높은 온도에서 컬럼의 조건을 다시 잡습니다. 그러나, 상한선은 초과하면 안됩니다.

   
   

   컬럼을 설치할 때, 조건온도로 올리기 전에 적어도 운반기체의 세 배에 해당하는 부피를 가지고 컬럼을 퍼지(purge)시킵니다. 총 컬럼 조절 시간은 하고자 하는 응용의 유형과 얼마나 많은 방출(bleed)이 수용될 수 있는가에 따라 결정됩니다. 요구되는 검출기 한계가 낮을수록, 조건을 잡아야 할 컬럼의 길이는 더욱 길어집니다. (컬럼 방출은 고정상의 극성과 필름 두께와 밀접하게 연관되어 있습니다.) 극성을 띠며 두꺼운 필름의 컬럼들은 많은 방출을 보이게 되며 더 많은 조건들이 필요합니다.

   
   

   대부분의 경우 조건을 잡기위해30-60분의 시간이면 충분합니다. 그러나 컬럼이 충분히 조건이 잡혔나를 어떻게 확실히 결정할 수 있을까요? 플레임 이온화 검출기(flame ionization detector, FID)는 조건 잡을 때 기준선을 감지하는 역할을 잘합니다. 기준선은 온도 경사의 끝까지(즉, 등온 상한선 밑인 30-40°C) 올라갔다가 다시 내려올 것입니다. 이때 여러분은 컬럼의 조건이 잡혔다고 여겨도 됩니다. 다른 종류의 검출기(e.g., ECD, MS)들을 사용할 때, 조건을 잡는 동안 검출기가 더러워진 경우가 보고되는 경우가 있지만 이러한 FID검출기들을 연결하는 동안 컬럼의 상태를 잡는 것은 일반적으로 안정한 방법이라고 여겨집니다.

   
   

   한가지 더 ! : 컬럼의 상태를 밤새도록 조절하지 마십시오. 고온에서 컬럼을 놓아두었을 때, 컬럼의 수명은 크게 감소합니다. 만약 두시간 이상 초과량의 블리드를 보게 된다면, 오븐의 온도를 상온으로 낮추고 문제의 원인을 찾습니다.(대체적으로 셉텀이 새거나 피팅이 느슨해 컬럼 안에 산소가 들어감). 컬럼 블리드를 최소화 하는 기준선 신호들은 GC 자체에 존재하는 잔여기들로부터 기인합니다.

   
   

   또 한가지! : 만약 컬럼이 잠시동안 사용되고 있지 않다면, 컬럼 내부에 축합되어 존재해 왔을지도 모르는 오염물질을 제거하기 위해서 mild한 과정이 요구될지도 모릅니다. 또한, 컬럼의 조건을 잡을 때 오븐의 램프 속도의 한계를 특별히 제안할 만한 기준이 없습니다.

6. Q.

   화학적으로 비활성화 주입 라이너(deactivate injection liner)들을 가질 수 있습니까? Inlet에서 반응성문제가 있는 것을 어떻게 알 수 있습니까?

   A.

   대부분의 inlet liner들은 Borosilicate glass (e.g., Pyrex)로 만들어 집니다. Borosilicate glass 는 기체 크로마토그래피에 대해 특징적인 장점들을 보입니다. 이것은 낮은 열 팽창계수를 가지며 열적 충격에 저항성을 띠고 있습니다. 대부분의 유리들은 Lewis acid 위치를 가지고 있고 borosilicate에서는 붕소(B), 금속 산화물 그리고 표면 실라놀(silanol)에 존재합니다. 이러한 site들은 용질의 감소에 기여 할 수도 있습니다. 따라서, 크로마토그래피적 반응성 용질들에 대한 감도를 상실하거나 피크 흔적을 경험하게 될 때, inlet liner에서의 반응성 문제를 경험하게 될 수도 있습니다. 비활성화 과정은 두 가지 기본적인 경로를 수반합니다. 즉, 유리 표면의 금속 산화물을 제거하는 여과(leaching)과정과 표면의 실라놀을 비활성화 시키는 유도(derivatization)과정이 있습니다. 여과과정은 inlet liner를 25%의 미네랄산 용매(염산, 질산, 황산 등이며 크롬산은 제외)에 대개 상온에 서 하룻밤 동안 담그는 과정을 포함합니다. 산성 용매가 천천히 가열(65°C)될 때 비활성화 과정의 일부분이 몇 시간으로 짧아질 수 있습니다. 
   
   유도과정(derivatization step)은 더 많은 것이 포함됩니다. 여과가 끝난 후 liner는 유리2)의 표면의 물을 제거할 수 있도록 가열되고 나서, 표면의 실라놀 그룹을 비활성화 시킬 수 있는 화학제로서 유도됩니다. 유도제의 선택은 수없이 많고 방법들도 매우 다양합니다. 비록 단순한 비활성화 과정들이 존재하고 매우 효과적이지만(40-50%) 공정은 매우 철저한 비활성화 과정이어서 일반 상업적으로 가능한 것 보다 화학적으로 불활성한 liner를 생산해 냅니다. 이 과정은 매우 반응성이 있는 화합물에 대해 특히 효과적입니다.

7. Q.

   플로우미터(flowmeter)에 대해 unretained 화합물을 주입한 후 얻은 값과 흐름을 계산해서 얻은 값이 다르게 나왔습니다. Unretained 화합물들은 30m, 0.32 mm I.D. DB-5에서 1.04 min에 용리되었고 흐름속도가 2.31 mL/min로 계산되었습니다. 반면에 플로우미터는 4.59 mL/min의 흐름 속도라고 합니다. 계산이 틀린 것입니까? 혹은 플로우미터가 틀린 것입니까?

   A.

   두 가지 모두 정답입니다. 그러나 각기 다른 질문에 대한 대답입니다. 플로우미터는 컬럼의 출구 끝 부분에서 흐름속도를 측정한 것이 고 반면에 계산된 속도는 컬럼의 평균적인 속도를 측정한 것입니다.

8. Q.

   Flow cell의 공기방울은 어떻게 해야 쉽게 없앨 수 있나요? 또 생기지 않도록 예방하는 방법은 무엇인가요?

   A.

   Flow cell에 공기방울이 생기지 않도록 하는 가장 좋은 방법은 이동상을 degasser에 통과 하는 방법입니다. 그러나, degasser module을 사용할 수 없을 때에는 helium을 사용하여 공기방울들이 이동상에 녹을 수 없도록 방지 하는 방법(Helium Sparge)도 있습니다. 검출기 부분에 Backpressure를 주는 방법도 버블을 제거 할 수 있는 방법 중 하나이지만, 이 경우에는 반드시 flow cell 의 최대 압력을 지켜 flow cell이 손상을 입지 않도록 주의 해야 합니다. Flow cell의 공기방울을 없애기 위한 다른 방법은 컬럼을 제거하고, 펌프에서 바로 검출기로 이동상의 라인을 연결합니다. 연결 후 isopropanol을 빠른 유속으로 흘려주면서, baseline이 공기 방울 때문에 튀지 않고 안정화가 되는지 살펴봅니다. 베이스라인의 이상이 없으면 공기방울이 모두 제거 되었다고 판단할 수 있습니다.

9. Q.

   Baseline이 안정이 안되고 흔들립니다. 어떻게 해야 안정화를 시킬 수 있을까요?

   A.

   베이스라인의 불안정은 대부분 오염에 의하여 발생하는 것입니다. 오염의 제거를 위해 컬럼을 깨끗이 세척하고, 분석하는 샘플을 깨끗이 전처리 하고,이동상을 새로 만드는 것이 기본입니다. 베이스라인이 아래로 떨어지는 현상(negative drift)이 발생하는 경우는 실험실 혹은 컬럼 오븐의 온도가 불안정할 경우 종종 발생 하기 때문에 실내 온도를 일정하게 유지 할 수 있도록 하기 위해 문 옆이나, 직사광선을 받을 수 있는 장소를 피해 장비를 설치 해야 합니다. 또한 컬럼이나 이동상이 이동하는 라인에도 온도가 일정할 수 있도록 하는 것이 좋습니다. 베이스라인이 떨어지는 또 다른 이유 중 하나는 이동상의 순도가 HPLC grade가 아닌 것을 사용할 경우 UV 흡수가 발생하여 베이스라인의 이상이 생길 수 있으므로 반드시, 이동상은 HPLC Grade로 사용 해야 합니다.

10. Q.

    Baseline의 잡음(Noise)을 줄이기 위해서는 어떻게 해야 하나요?

    A.

    불규칙한 잡음(noise)은 오염에 의해 발생하는 경우가 많이 있습니다. 기본적으로 컬럼의 세척 및 주입시료의 전처리, 그리고 깨끗한 이동상을 사용해 주어야 합니다. 계속적으로 잡음(noise)가 보일 경우에는 검출기 혹은 이동상의 흐름에 문제가 있을 경우 발생합니다. 검출기의 문제인지 아니면 펌프의 펌핑 시스템에 문제가 있는 것인지 확인하기 위해 유속을 멈추고 베이스라인을 살펴봅니다. 만약 유속이 “0”일 경우 베이스라인이 평평하게 된다면, 잡음(noise)의 원인은 이동상의 흐름 즉 펌핑 시스템에 문제가 있는 경우 입니다. 유속이 “0”일 경우 베이스라인의 잡음(noise)가 계속 된다면, 검출기의 원인이므로 램프를 교체합니다.

11. Q.

    Baseline의 튀는(spiking)현상을 없애기 위해서는 어떻게 해야 하나요?

    A.

    튀는 현상(spiking)이란, 아무것도 주입하지 않은 상태에서 베이스 라인에 막대기 같은 줄이 푝푝 나타나는 현상입니다. 이 막대기 같은 줄은 일반적인 피크(peak)가 아니므로 분석시 제거 되어야 하는 현상입니다. 유속을 “0”으로 하였을때 튀는 현상이 멈춘다면 이것은 공기방울에 의한 현상입니다. 시스템의 공기를 제거하고, 유속을 흘려 주었을 때도 튀는 현상이 발생한다면 검출기 내의 전기적인 잡음(noise)이므로 엔지니어에게 확인을 받는 것이 좋습니다.

12. Q.

    크로마토그램중에 유령피크(ghost peak)가 발생합니다. 어떤 경우 유령피크가 발생하며, 어떻게 해야 없앨 수 있나요?

    
    

    A.

    1. 유령피크(ghost peak) 발생 원인
    •주입 이전 분석 물질이 나올 경우
    •시스템 및 컬럼 오염의 경우
    •공기방울
    •컬럼 오염
    •가드 컬럼의 오염

    
    

    2. 유령피크(ghost peak)제거 방법
    •용리(elution) 시간을 충분히 두어 모든 시료의 피크가 나올 수 있도록 합니다. 또한 분석 후 강한 용매를 사용하여 컬럼을 씻어 줍니다.
    •오염 물질을 각 시스템과 컬럼 으로부터 씻어냅니다.
    •시스템 내에 공기방울이 없을 경우, 이동상 용매 중 공기 방울이 있을 가능성이 높으므로 degassing을 확실히 해줍니다.
    •컬럼을 교체하거나, 충분히 세척합니다.
    •가드 컬럼을 교체합니다.
    •이동상의 불순물이 들어갔는지 확인합니다.
    •샘플 중 추가의 unknown 물질이 첨가가 되었는지 확인합니다.

13. Q.

    어떤 컬럼을 사용해야 하며 이유는 무엇 때문인가요?

    A.

    분석하고자 하는 고분자의 정확한 분자량 분포를 얻기 위해서는 컬럼의 선택이 결정적입니다. 초기에 고려해야 할 요소는 용해도입니다.

    *수 용 성 : Ultrahydrogel column line
    *유기용매성
    - HR for high resolution work
    - HT for high temperature work
    - HMW for ultra high molecular weight polymers

14. Q.

    어떤 용매를 구입해야 하며 이유는 무엇인가요?

    A.

    HR, HT, HMW 컬럼들은 THF/Toluene/DMF과 같은 물질로 충진 되어 있습니다. HFIF(hexafluoroisopropanol)로 실온에서 분석을 하기위해 메탄올로 특별히 충진된 특수 컬럼이 가능합니다. 이러한 4개 이상의 용매를 사용하고자 합니다면 고려해야 할 사항들이 있습니다. 클로로포름이나 메틸렌 클로라이드같은 용매에서 “상온” 분석을 하고자 합니다면, THF로부터 변환시킵니다. TCB, ODCB에서 고온의 조건하에서 분석하고자 합니다면 ~85-90 oC의 toluene에서 변환시킵니다. DMAC(Dimethylacetamide) 또는 NMP(n-methylpyrollidone)와 같은 매우 극성인 용매를 사용하고자 합니다면DMF에서 변환시킵니다.

15. Q.

    현재 컬럼의 용매는 “A인데 다른 용매로 바꿀 수 있나요?

    A.

    일반적으로, 두 용매가 섞일 수 있다면 한 용매에서 다른 용매로 0.1 ? 0.2 ml/min속도 범위에서 직접적으로 바꿀 수 있습니다. 만약, 용매가 섞이지 않는 것들이라면 중간체 용매가 쓰일 것입니다.

16. Q.

    GPC 컬럼에서 flow rate는?

    A. 7.8 mm i.d.의 분석 컬럼에 대해서 1.0 ml/min의 속도를 초과하지 않는 것이 좋습니다. 이러한 컬럼들에 대해서 “최적”분해능은 약 0.70 ~ 0.80 ml/min 정도입니다. 4.6mm i.d. narrow bore 컬럼들에 대한 optimum flow rate는 0.3 ? 0.35 ml/min입니다. 더욱 자세한 정보를 위해서는 사용 설명서를 참조하세요.

17. Q.

    컬럼을 스타트할 때 flow를 점차적으로 증가 시켜야 하나요?

    A.

    분석용 GPC 컬럼들에 대해, 특히 HR 시리즈에 대해서 flow rate를 서서히 올리는 것이 의무적입니다. Flow의 갑작스러운 증가는 컬럼을 손상 시킬 수 있습니다. 온도 ramping은 그렇게 결정적이지 않습니다. 일반적으로 60초 interval의 0.0에서 1.0ml/min flow rate를 상온에서 150 ℃까지의 온도범위에서 몇 시간 동안 서서히 올립니다.

18. Q.

    컬럼들의 pore 크기 범위를 어떻게 선택합니까?

    A.

    Pore의 size 범위는 관심 있는 시료의 대략적인 분자량 범위 결정에 의해서 선택됩니다. 예를 들어서 103, 500, 100의 컬럼 set보다 분자량 범위가 작다면(예로, epoxy resin) 아마도 50A 컬럼이 사용될 것입니다. 만약 시료가 medium molecular weight PVC이면 103, 104, 105 set이 쓰일 것입니다. Polymer의 분자량 범위에서 각각의 pore 크기를 선택하는 것은 가장 좋은 분해능을 제공하게 됩니다. 만약 분자량 범위가 알려져 있지 않고 매우 broad하다면 pore 크기들의 mixture를 제공하는 mixed bed 컬럼(linear 또는 extended range)을 사용하는 것이 좋은 생각입니다.

19. Q.

    필요한 분해능은?

    A.

    GPC 분석에서 분해능은 용리되는 불확실한 부피에 있어서 분리되는 분자량의 범위를 의미합니다. 일반적으로 분해능을 최고로 하기를 바랍니다. 분해능을 가장 좋게 하기위한 방법은 컬럼을 몇 개 더 증가시키는 것입니다. 또 다른 방법은 효율을 증가시킬 더욱 작은 크기의 입자를 사용하는 것입니다. 컬럼의 내구성과 생명이 선택 사항 입니다. 올리고머, 첨가제, multi-modal distributions들이 존재하는 분리에서는 분해능이 중요할 지도 모른다. 만약 시료가 넓은 분포를 가지는 고밀도 폴리에틸렌이면 분해능은 그다지 중요하지 않을 지도 모릅니다.

20. Q.

    “Narrow” standard와 “broad” standard가 무엇입니까?

    A.

    “Narrow” standard들은 다분산도(Polydispersity)가 1.10보다 작은 경우를 말합니다. 다분산도는 수평균 분자량(Mn)에 대한 무게 평균 분자량(Mw)의 비로 정의됩니다. “Broad” standard들은 1.10보다 큰 다분산도를 가지며 보통 분석해야 할 시료와 같은 종류의 고분자입니다.